Entender que es una prueba de PCR

La PCR es una técnica utilizada en biología molecular que permite conseguir una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN, partiendo de una cantidad ínfima de esta biomolécula. Esta técnica fue diseñada tal y como la conocemos por los bioquímicos Kary Banks Mullis y Michael Smith en la década de los 90, quienes consiguieron patentarla.

La PCR se basa en una actividad enzimática que sucede de forma normal en las células de nuestro organismo. En las células, las ADN polimerasas son capaces de replicar el ADN nuclear, para obtener dos copias idénticas, que después serán repartidas a las células hijas en la mitosis. Bien, pues, de igual modo, en la PCR las polimerasas serán capaces de replicar, cual fotocopiadora, un fragmento de ADN, en varios ciclos, para obtener una gran cantidad de copias igualitas a ella. Basta partir de una única copia de un fragmento original, o molde.

¿Para qué sirve una PCR?

Todo investigador que trabaje con moléculas de ADN conoce esta técnica. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Y es que la PCR es una técnica imprescindible en diferentes ámbitos. Por ejemplo, en investigación bioquímica y médica, la PCR permite preparar fragmentos de ADN para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como vectores, paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas. Además, en Medicina, esta técnica es utilizada para diagnosticar enfermedades hereditarias. También para identificar patógenos.

La PCR es una técnica importantísima en las pruebas de paternidad y en los análisis forenses de la policía científica.

¿Qué se necesita para hacer una PCR?

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Ingredientes para PCR

Seguir el procedimiento de una técnica de laboratorio requiere de ingredientes. Los ingredientes esenciales para llevar a cabo una PCR son los siguientes:

ADN molde

Se trata del fragmento de ADN que queremos amplificar mediante la PCR.

Desoxirribonucleótidos-trifosfato:

El ADN está compuesto por 4 tipos de nucleótidos, formados por 4 bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina. Es de esperar, entonces, que estos 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato sean indispensables para poder obtener nuevas moléculas de ADN

Cebadores (en inglés, primers)

Los cebadores son oligonucleótidos, secuencias cortas de ADN, que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos cebadores, cada uno complementario a una cadena del ADN que buscamos amplificar. Estos oligonucleótidos determinan la región del ADN a amplificar.

ADN polimerasas

Muy importantes en esta técnica bioquímica. En la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas de varios organismos. Sin embargo, la más utilizada dada su efectividad, es la ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, también llamada Polimerasa Taq. Esta polimerasa es idónea para la PCR por su resistencia a las altas temperaturas que se utilizan en el proceso.

Iones divalentes de magnesio

En la PCR se utilizan iones de carga positiva como cofactores de la polimerasa. Estos cationes son esenciales para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de magnesio para que al disociarse se libere magnesio ( con carga +2).

Solución tampón

Una solución tampón es una disolución que es capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR o evitar que se produzca.

Estos son los ingredientes básicos. Sin embargo, como en cualquier receta de cocina, necesitamos algo (un instrumento) para procesar los ingredientes y conseguir los resultados que buscamos. En el caso de la PCR es muy importante regular las condiciones de temperatura en las que se encuentran las reacciones. Para ello, se utiliza un “horno” especial, el termociclador.

Termociclador

Un termociclador es un aparato que regula la temperatura en cada ciclo de la PCR. Gracias a él es posible realizar esta técnica en muchísimo menos tiempo, ya que para realizarla, se debe modificar la temperatura de la solución en varias ocasiones.

Ya sabemos qué elementos básicos necesitamos para realizar una PCR. Ahora, solo nos queda conocer el procedimiento a seguir en esta técnica:

¿Cómo funciona una PCR?

La PCR se compone de varios ciclos, que se repiten unas 30 veces, dependiendo de la cantidad de muestra que necesitamos. Cada ciclo comprende la desnaturalización de la doble hebra de ADN y la síntesis de la una nueva cadena de ADN por cada cadena haya presente. De este modo, si comenzamos con una única molécula de ADN en la muestra, obtendremos 2 en el primer ciclo, 4 en el segundo ciclo… ¡y 2 147 483 648 moléculas en el ciclo número 29!

En la primera parte del ciclo de una PCR, se desnaturalizan la moléculas de ADN de la muestra. Esto significa que las dos cadenas que forman cada molécula se separan, dando lugar a dos moléculas de ADN monocatenario. Normalmente, este primer paso se logra realizar mediante un aumento muy grande de la temperatura de la solución (aproximadamente a 95º).

El siguiente paso de un ciclo de la PCR implica unas moléculas muy importantes, de las que hablaba antes, los cebadores. En este paso, se disminuye la temperatura de la solución para favorecer la unión de los cebadores al ADN monocatenario que habíamos obtenido en el proceso anterior. Recordad que los cebadores se unen al ADN de forma específica, así que solo amplificaremos la región de las moléculas que nos interese.

Acto seguido, se ajusta la temperatura de la solución de nuevo, para que la ADN polimerasa pueda actuar a partir de los cebadores. La temperatura en este paso es dependiente de la ADN polimerasa que se esté utilizando. Por ejemplo, para la polimerasa Taq, la temperatura ideal está entre los 70 ºC y los 80 ºC. En este paso, la polimerasa utiliza como molde las cadenas de ADN monocatenario y va añadiendo al cebador los desoxirribonucleótidos-trifosfato complementarios a la cadena molde, formando una nueva cadena.

Aquí un esquema de la reacción en cada ciclo:

Esquema Ciclo PCR

 

Una vez se ha realizado un ciclo, se repiten los pasos de nuevo. De este modo, las cadenas obtenidas en el primer ciclo se utilizan como molde en el segundo ciclo, las obtenidas en el segundo se usan como molde en el tercero y así consecutivamente.

Este es el tipo de PCR más sencillo. Sin embargo, existen muchas variaciones de esta técnica que nos permiten obtener diferentes resultados. Veamos algunas de ellas:

Otros tipos de PCR

PCR anidada: se trata de una variante de la PCR básica que utiliza dos pares de cebadores. En un primer paso, se realiza la amplificación de una región del genoma, para después concretar más la región mediante una segunda amplificación más específica. Esta PCR se utiliza para amplificar fragmentos muy específicos del genoma.

RT-PCR: Esta técnica convierte el ARN de una muestra en ADN. Para ello utiliza la transcriptasa inversa, una enzima utilizada por los retrovirus Se utiliza para múltiples objetivos. Por ejemplo se puede utilizar para saber si un gen se está expresando en una muestra biológica. También se utiliza para genotipar diferentes virus de ARN, como el SARS-Co-V o el VIH.

PCR cuantitativa: es una PCR que permite medir en tiempo real la cantidad de fragmentos que se van produciendo. Se utiliza a menudo para analizar la expresión de los genes.

PCR múltiple: en este tipo de PCR se realizan amplificaciones simultáneas de más de un fragmento de ADN. Para ello, se utilizan varios cebadores diferentes en una misma reacción.

PCR in situ: esta PCR se realiza en células o tejidos. Se utiliza para poder detectar secuencias de ADN en el interior de las células que no son detectables mediante otras técnicas.

PCR digital: es una de las últimas generaciones en técnicas de amplificación de ADN. Está basada en la separación de cada muestra en múltiples particiones (microgotas), de forma que la reacción de amplificación se produce de forma independiente cada una de ellas.

La prueba de PCR que se usa para detectar COVID es un tipo especial de PCR. En general, para detectar el coronavirus se utiliza una RT-PCR cuantitativa, donde se transforma el ARN del virus en ADN y posteriormente se amplifica para ser detectado.

La PCR con amplificación específica de alelo, es una PCR dirigida a diferenciar entre dos alelos o formas diferentes del fragmento de ADN a analizar. Lo que se hace es diseñar uno de los cebadores o primers de forma que sea específico de cada alelo a detectar. Para ello en el diseño del cebador específico de alelo se busca que la posición potencialmente esté en el extremo 3′ del cebador (el más cercano hacia donde se iniciará la síntesis). Se realizan PCR separadas para cada cebador específico de alelo. El segundo cebador es común. Esta estrategia se usa para determinar el genotipo de una muestra. Según qué reacción de PCR da lugar a una amplificación (con cebador de un alelo o de otro, o ambos) se puede establecer la combinación de alelos en la muestra. Es importante en cualquier caso, seleccionar condiciones de PCR restrictivas que aseguren que la amplificación es específica.

Estos solo son algunos de los tipos más conocidos de PCR, aunque también existen muchas otras variaciones de la PCR, como la PCR asimétrica, o la PCR específica de alelo, que consiguen diferentes resultados a partir de las muestras de ADN obtenidas.

Deja un comentario

*

Este sitio web utiliza cookies para que usted tenga la mejor experiencia de usuario. Si continúa navegando está dando su consentimiento para la aceptación de las mencionadas cookies y la aceptación de nuestra política de cookies, pinche el enlace para mayor información.plugin cookies

ACEPTAR
Aviso de cookies
Translate »